در روشهای آماده سازی نمونه ، رسوب دادن پروتئین ها به عنوان یک مرحله اختیاری تلقی می گردد . این روش برای جدا کردن انتخابی پروتئین ها از مواد آلاینده و تداخل کننده در محلول مانند نمک ها ، دترجنت ها ، اسیدهای نوکلئیک ، و غیره به کار گرفته می شود . از این روش برای تغلیظ پروتئین های موجود در یک نمونه که در حالت عادی بسیار رقیق باشند ، نیز استفاده می شود .
باید توجه داشت که هیچ روش رسوب دهی به طور کامل کارامد نیست و برخی از پروتئین ها بعد از رسوب داده شدن ، مجددا محلول نمی شوند . به همین دلیل بسته به هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی استفاده کردن از این روش را در دستور کار می توان قرار داد . در صورتیکه هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی به دست آوردن کاملترین نمایه دو بعدی یک نمونه باشد ، باید از انجام رسوبدهی صرف نظر کرد .
جزء به جزء کردن نمونه(Fractionation)
پروتئین هایی که در بافتهای اوکاریوتی بیان می شوند ، از گوناگونی بسیاری برخوردار بوده ، و دارای محدوده دینامیک (محدوده غلظت پروتئین های داخل یک نمونه بین کمترین تا بیشترین غلظت(Range Dynamic) ) وسیعی هستند . برخی از مواقع در نمونه هایی این چنین ، به منظور کاهش پیچیدگی نمونه و افزایش تعداد پروتئین هایی که دارای نسخه پایین هستند ، نمونه جزء به جزء می شود . می توان از روشهای متفاوتی مانند جزء به جزء کردن اجزاء سلولی (Sub-Cellular Fractionation) ، الکتروفورز در فاز مایع ، کروماتوگرافی جذبی و رسوبدهی انتخابی بهره برد . استخراج پی در پی (Sequential Extraction) پروتئین ها از یک سلول یا بافت بر اساس حلالیت آنها در دسته ای از بافر ها که قدرت و خاصیت محلول سازی آنها به تدریج افزایش پیدا می کند ، روش دیگری از جزء به جزء کردن است .
زمانی که قسمتی از پروتئین های سلول یا بافت مورد نظر باشد ، می توان در حین آماده سازی ، نمونه را نیز جزء به جزء کرد . اگر پروتئین هایی از یک قسمت زیر سلولی خاص مورد نظر باشند ، برای مثال ریبوزوم ها ، می توان ارگانل مورد نظر را توسط سانتریفوژ کردن تمایزی در شیبهای سوکروز جدا نمود . اگر چه این روشها را می توان در سلولهای پستانداران که معمولا دارای جداره سلولی ضعیفی هستند ، نیز به کار برد ، اما دسترسی به اورگانل ها در میکرواورگانیسم های دیگر بسیار مشکل است ، زیرا یک روش لیز کردن برای شکستن کارامد دیواره سلولی مورد نیاز است که در عین حال نباید آنقدر خشن باشد که باعث از بین رفتن ارگانل و تخریب آن شود .
رسوبدهی انتخابی بعضی از کلاسهای پروتئینی توسط استن-TCA صورت می گیرد . دیگر روش ، روشهای عصاره گیری متوالی با بافرهایی که به تدریج قدرت محلول سازی آنها افزایش می یابد ، است . مثلا بافرهای مائی ، حلالهای آلی نظیر اتانول ، کلروفورم و اتانول و محلول های حاوی دترجنتهای مختلف . بالاخره روشهای جداسازی کروماتوگرافی ، الکتروفورز در فاز مائی نیز در جزء به جزء کردن نمونه ها بر اساس خصوصیات فیزیکوشیمیایی متفاوت پروتئینهای موجود در نمونه قابل انجام هستند . تصمیم در انتخاب هر یک از این روشها بستگی به ماهیت نمونه و هدف از کار با نمونه دارد .
روشهای جزء به جزء کردن ، ممکن است مزایای بسیاری در غنی سازی پروتئین ها داشته باشند ، اما اصلی ترین نکته منفی در استفاده از این روشها ، این است که بسیار زمانگیر و بسیار پیچیده اند . همچنین نمی توان در یک زمان چند نمونه را وارد این مرحله از کار نمود . اما مزیت اصلی آن ،تعیین جایگاه پروتئین ها از نظر ساختمانی در زیر ساختار سلولی و تعیین عملکرد آنها است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
در روند تخلیص ، خلوص ، مقدار ، حفظ اکتیویتی پروتئین و اقتصادی بودن شرایط مالی و زمانی بسیار مهم است . خلوص مورد نیاز باید از بررسی نوع منابع مادی ، تعیین نوع استفاده از فراورده نهایی ، و ایمنی آن تعیین شود . برای مثال اختلاف بین آلودگی هایی که باید از نمونه برداشته شود و آلودگی هایی که می تواند در آن باقی بماند ، مهم است . فاکتورهای دیگری هم هستند که تأثیر گذارند . بازده بالا معمولا یک کلید مهم است . همچنین زمان پروسه با یک Assay آهسته ما را به کمترین بهره وری سوق می دهد . همه اطلاعات ما درباره خصوصیات پروتئین هدف و آلودگی های آن ، به ما در طی روند تخلیص کمک می کند و به ما اجازه می دهد ، سریعترین و راحت ترین تکنیک ها را انتخاب کرده و بهره وری بالایی داشته باشیم و از وضعیتی که ممکن است پروتئین هدف غیرفعال شود ، احتراز کنیم .
ایجاد یک تست Assay سریع و قابل اطمینان و تعیین فعالیت پروتئین ، برای ادامه پیشرفت در روند تخلیص ، ضروری است . ( بازده ، فعالیت بیولوژی ، بازیافت )
ادامه مطلب مخصوص اعضاء
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در سه شنبه 28 دی 1389برچسب:تخلیص پروتئین ها,
در ساعت8:53 | |
تخلیص پروتئین ها ( بخش اول )
مقدمه
پیشرفت تکنیکها و روشها برای تخلیص پروتئینها ، برای پیشرفت بیوتکنولوژی ضروری است . این هند بوک که از اطلاعات و مثال های فراوانی تشکیل شده است ، برای هموار شدن مسیر تخلیص پروتئین ها تهیه شده است . گوناگونی مراحل تخلیص پروتئین از یک ته نشینی ساده تک مرحله ای ، تا یک پروسه معتبر لارج اسکل (Large Scale) ، می تواند باشد . اما اغلب ، بیشتر از یک مرحله برای رسیدن به خلوص مورد نظر ، برای تخلیص پروتئین ها مورد نیاز است .
کلید موفقیت و مؤثر بودن یک تخلیص ، در انتخاب کردن و برگزیدن از بیشترین تکنیکهای مناسب ، بالا بردن کارآیی توسط جور کردن ملزومات ، و آمیختن آنها در یک راه منطقی ، که مستلزم حداقل تعداد مراحل و حداکثر محصول است . در بیشتر طرحهای خالص سازی ، مبحث یکی از انواع کروماتوگرافی به میان می آید . چنانچه در هر آزمایشگاه تخلیص پروتئین ، ابزار کروماتوگرافی بسیار ضروری است . تکنیک های مختلف کروماتوگرافی با انتخاب پذیری های متفاوت ، می تواند ترکیب قدرتمندی را برای تخلیص هر بیومولکول ایجاد نماید . توسعه تکنیک های recombinant DNA انقلابی در تهیه پروتئین ها در مقیاس بالا می باشد . پروتئین های recombinant اغلب با روش راحت تری تولید می شوند ، اما بعد از تولید ، نوبت مرحله تخلیص به روش کروماتوگرافیست و این روش هنوز در همه تولیدات ، کاربردی است . گروههای آلوده کننده و مشکلات مربوط به انحلال آنها، ، حفظ ساختمان بی عیب و فعالیت بیولوژیکی مواردی است که باید ملاحظه شود .
اگر چه در آن ممکن است پارامتر های فراوانی ظاهر شود ، که باید ملاحظه شود ، اما با تعدادی راهنمایی ساده و همچنین به کارگیری سه مرحله در استراتژی تخلیص ، فرایند می تواند به صورت ساده و راحتی طراحی و انجام شود . این امر ممکن نیست مگر با دانستن اصول بنیادی و تفصیل تکنیکهای کروماتوگرافی .
ادامه مطلب مخصوص اعضاء
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در سه شنبه 18 دی 1389برچسب:تخلیص پروتئین ها,
در ساعت9:5 | |
پروتئومیکس و معالجه بیماری های صعب العلاج
آنالیز ، تخلیص و شناخت پروتئینها ، که هر کدام از آنها وظیفه ای خاص دارند ، باعث می شود ، بشر در آینده نزدیک کارهایی بتواند انجام دهد که نظیر نداشته باشد و تا به حال قادر به انجام آن نشده است . یکی از این کارها ، در زمینه پزشکی و ساخت دارو ها و معالجه بیماران صعب العلاج است . همانگونه که می دانیم بسیاری از بیماری ها به دلیل عدم سنتز یک ، یا چند نوع پروتئین است ، که خود این عدم سنتز می تواند علت های خاصی داشته باشد . هورمونها و آنزیم ها و مولکولهای مهمی ، که عدم وجود آنها ، مشکلات فراوانی را سبب می شود . پروتئومیکس در تشخیص این پروتئین ها کمک شایانی انجام می دهد . مثلا تشخیص پروتئین هایی که فقط در سلول های سرطانی تشکیل می شود ، و در سلولهای سالم دیده نمی شود . یا در تشخیص پروتین هایی که وجود و یا عدم وجود آنها ، در مغز یک انسان ، مشکلات خاصی مانند ms و عقب ماندگی های ذهنی و نظایر آنها ، ایجاد میکند . این رشته می تواند به پزشکان در ایجاد راهکارهایی برای درمان این نوع از بیماریها کمک کند . پزشکانی که روحیه تحقیق داشته باشند ، می توانند ایده های خوبی را دنبال کنند ، که فقط راه رسیدن به تحقق آنها ، پروتئومیکس و ژنومیکس است .
به عنوان مثال ، می توان سلول های مغز یک انسان عقب افتاده ذهنی را ، با سلول های مغز یک انسان سالم ، مقایسه کرد ( این بیماریها که اکثرا تا به حال ، لا علاج و ژنتیکی هستند ، بسیار جای کار دارند ) . این کار فقط با روش الکتروفورز 2 بعدی امکان پذیر است . اگر بیماری فرد ، به خاطر عدم سنتز یک یا چند نوع پروتئین باشد ، اگر بتوانیم این پروتئین ها را تهیه و تخلیص کنیم و یا به صورت مصنوعی ، یا روش های ژنومیکس سنتز کنیم و آنگاه ، به سلول برسانیم ، در حقیقت کلید حل این بیماری را یافته ایم و گام بزرگی را برداشته ایم .
نویسنده : ابوذر عسکری
9/10/1389
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در دو شنبه 9 دی 1389برچسب:پروتئومیکس,
در ساعت2:24 | |
مراحل خالص سازی پروتئین ها
مراحل تخلیص پروتئین ها به صورت شماتیک در ادامه مطلب توضیح داده شده است .
ادامه مطلب ، مخصوص اعضاء
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
اثر ویسکوزیته نمونه بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون
به ترتیب از A به C به وسیله افزودن دکستران , ویسکوزیته زیاد شده است .
ویزکوزیته زیاد باعث کم شدن رزولیشن می شود . همچنین ویزکوزیته نمونه نباید در حدی باشد ، که حرکت آن در هنگام عبور از میان ذرات ژل ، با مشکل مواجه شود . یعنی در اثر نیروی مکشی که در اثر خروج بافر (فاز متحرک ) ، یا فشار پمپ ، ایجاد می شود و عدم عبور راحت نمونه از میان ذرات ژل ، ژل فشرده نشود.
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
اثر حجم نمونه تزریقی بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون
به ترتیب از آبی به قرمز حجم نمونه تزریقی به ستون ژل فیلتراسیون اضافه می شود .
حجم تزریقی نمونه به ستون کروماتوگرافی به روش ژل فیلتراسیون 2 الی 5 درصد حجم ژل می باشد . 2 درصد ایده آل و 5 درصد قابل قبول است . بدیهی است که در صورت افزایش این درصد کیفیت و رزولیشن گراف پایین می آید . همان طور که مشخص است در گراف قرمز ، پیک ها شارپ نیست ، یعنی عرض آنها زیاد است و مقدار جذب کمتری را در قله می بینیم . این امر باعث می شود که رزولیشن کمتری داشته باشیم.
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
اثر سرعت فاز متحرک بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون
اثر سرعت فاز متحرک بر جداسازی و رزولیشن ستون های ژل فیلتراسیون
سرعت ، در جداسازی پروتئینهای یک نمونه تأثیر دارد ، در حقیقت کاهش سرعت فاز متحرک رزولیشن (Resolution) کروماتوگرافی را زیاد می کند ، همچنین باعث شارپ شدن پیک ها می شود . همانگونه که در گراف نارنجی مشخص است ، رزولیشن و ارتفاع پیک ها بیشتر است .
در این نمونه 7 نوع پروتئین وجود دارد ، گراف های بالا بر حسب (جذب پر حجم) (Abs/V) ولی گراف پایین بر حسب (Abs/min) است .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
جهت كاهش حجم و تغليظ و تخلیص پروتئينها , از روشهای مختلف رسوب دهی مانند رسوب دهی به وسيله نمك ، حلال های آلی و حلال های پليمری استفاده می شود .
رسوب دهی به وسيله نمك :
روش عمومی براي انجام عمل رسوب دهی استفاده از نمك است كه با افزايش مقدار نمك حلاليت پروتئينی كم شده و به هم پیوسته و رسوب می کند . قدرت رسوب دهی نمك ها , به صورت ذرات آنيوني و كاتيون در زیر نشان داده شده است .
از طريق هيدراته شدن یونهای مثبت و منفی نمك افزوده شده در محلول و دور كردن مولكولهای آب از سطوح هيدروفوب پروتئينها و درنتيجه اين سطوح هيدروفوب به هم پيوسته و رسوب می نمایند .
رسوب دهی به وسيله حلال های آلی :
با افزايش حلال آلی ، قدرت حلاليت مولكولهای باردار آب دوست پروتئينها در محيط آبی كم شده و باعث به هم پيوستن ذرات مولكولی و رسوب دهی آنها می شود . ( مانند مكانيزم رسوبدهی پروتئين ها در نقطة ايزوالكتريك , در غلظتهای پايين نمك) . به عنوان مثال اتانل , در جداسازی پروتئينهاِی پلاسمایی بسيار مورد استفاده قرار مي‌گيرد .
رسوب دهی به وسيله پليمرهای آلي :
این روش , مانند روش استفاده از حلال آلی و از طريق كاهش فعاليت محيط آبی است. به عنوان مثال Poly Ethylen Glycol , در جداسازی پروتئينهاِی پلاسمایی , فراوان مورد استفاده قرار مي‌گيرد .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
افینیتی کروماتوگرافی یکی از روش های جداسازی نمونه های پروتئینی است که خیلی زیاد مورد استفاده قرار می گیرد و بسیار گزینش پذیر و مؤثر است . این تکنیک بر پایه اثرات متقابل منحصر به فرد موجود بین یک مولکول و یک لیگاند متصل به یک ماتریکس است .
کارهای لازم برای طراحی یک افینیتی کروماتوگرافی عبارتند از :
1- پیدا کردن یک لیگاند که ویژگیهای کافی داشته باشد .
2- پیدا کردن شرایط مناسبی که در آن لیگاند و پروتئین هدف به هم متصل شوند . همچنین به همان راحتی هم بتوانند از هم جدا شوند .
مراحل کار با کروماتوگرافی افینیتی را می توان به 3 مرحله اصلی تقسیم کرد .
1-Equilibration :
اولین قدم در کروماتوگرافی افینیتی آماده سازی فاز ساکن است . فاز ساکن معمولا ترکیبی است حل نشدنی از یک پلیمر هیدروفوبیک , برای مثال , آگاروز . باید این فاز را با بافرهای لازم به تعادل رساند و شرایط را برای چسبیدن پروتئین هدف آماده کرد .
2-Application of Sample :
در یک نمونه که حاوی انواع مختلف پروتئین می باشد , پروتئین هدف جلب فاز ساکن می شود , به آن متصل می شود و سایر پروتئین ها به راحتی از میان فاز ساکن عبور می کنند و شسته می شوند . موفقیت این بخش , به مقدار توانایی مولکول هدف برای متصل شدن به لیگاند بستگی دارد . ثابت تفکیک (KD) وابسته است به مقدار نیروی موجود بین مولکول هدف و لیگاند . (KD) کمتر یعنی پیوند قویتر . مقدار (KD) بین 10 به توان 4- و 10 به توان 6- ایده آل برای متصل شدن پروتئین هدف و فاز ساکن می باشد . اگر (KD) بسیار بزرگ باشد , پروتئین هدف به ستون نمی چسبد . اگر (KD) خیلی کوچک باشد , پروتئین هدف به سختی به لیگاند ها متصل می شود و به صورت برگشت ناپذیر جذب آن می شود . در طی شستشو , به استثنای پروتئین هایی که محکم به فاز ساکن چسبیده اند , اغلب مولکولهایی که دارای اثرات متقابل ضعیف هستند , توسط مثلا , یک محلول حاوی غلظت بالای نمک , شسته می شوند .
3-Elution :
به دنبال شست و شو در مرحله آزاد سازی پروتئین ها به صورت یک باند از فاز ساکن جدا می شوند . پس از اینکه نمونه هدف به فاز ساکن چسبید , گرادیانت بافر لازم است . در کروماتوگرافی افینیتی باید شرایط چسبیدن و شرایط رها شدن به راحتی فراهم شود .
2 راه برای شست و شوی مولکول هدف از فاز ساکن وجود دارد .
1- تغییرمقدار (KD) از کم به زیاد . مقدار (KD) ایده آل برای شست و شو معمولا بین 10 به توان 1- و 10 به توان 2- می باشد . همچنین مقدار (KD) می تواند با تغییر شرایط عوض شود . شرایطی مثل غلظت نمک , PH و دما .
2- اضافه کردن ماده ای که به عنوان رقیب به لیگاند متصل شود و باعث آزادی پروتئین هدف شود . یا ماده ای که به عنوان رقیب به پروتئین هدف متصل شود و همراه آن , به وسیله بافر از ستون و فاز ساکن شسته شود .
شکل شماره 2 : آزادسازی پروتئین های هدف به وسیله پروتئین های رقیب
شکل شماره 3 : آزادسازی پروتئین های هدف به وسیله لیگاندهای رقیب
مولکولهای هدف :
3 گروه از مولکولهای هدف وجود دارند که می توان در آن از روش افینیتی کروماتوگرافی استفاده کرد .
1- اتصالات ویژه مستقر بر روی مولکولهای زیستی فعال : این مولکولها شامل رسپتور , آنتی بادی وآنزیم های فعال می باشند . این مولکولها توسط لیگاندهای طبیعی خود یا لیگاند های شبیه به آن مورد استفاده قرار می گیرند .
2- گروههای مصنوعی که روی مولکولهای طبیعی قرار گرفته اند : برای مثال پلی ساکارید ها . این کار برای جداسازی گروهی آن سودمند است .
3- مولکولهای مهندسی شده که شامل یک برچسب افینیتی است : برای مثالی از این نوع برچسبها GST مخفف Glutathione-S-Transferase یا پروتئین هایی با هیستیدین قابل دسترسی . این برچسب ها اکثرا مهندسی شده تا پروتئین ها جداسازی شوند .
لیگاندهایی که فقط مخصوص یک مولکول خاص باشند را کمتر می توان به صورت یک ماتریکس تجاری پیدا کرد . لیگاندهایی که برای یک گروه خاص استفاده می شوند معمولا به صورت تجاری قابل دسترس هستند , زیرا بیشتر مورد استفاده قرار می گیرند . لیگاندهای کوچک تر ممکن است در بدست آمدن نتایج مشکلاتی را به وجود آورند . یکی از آنها تداخل شکل فضایی است .دیگر مشکل عدم دستیابی به لیگاند است .
شکل شماره 4 : وقتی لیگاند یک فاز ساکن تهیه می شود , اغلب لازم است که دارای یک بازوی بلند باشد , تا مانع از تداخل و اتصال مولکول و لیگاند نشود .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
تالیف مصطفی رضایی طاویرانی، سید امیر مرعشی، زھرا قلنبر و مھرناز مصطفوی
"بیوفیزیک"
تالیف مصطفی رضایی طاویرانی و ھمکاران
مقدمه و مفاهیم اولیه پروتئومیکس
پروتئومیکس روشی معقول براي ایجاد ارتباط بین اطلاعات موجود در توالی نوکلئوتیدي و خصوصیات عملکردي یک سلول میباشد از پروتئومیکس و تکنیکهاي آن در تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی، توصیف موتانتها، شناسایی و توصیف اثر عوامل غیر زنده بر موجود از طریق پروتئینهاي پاسخگو، مقاومت موجود به استرس و غیره در زمینه هاي مختلف از جمله پزشکی، کشاورزي، صنعتی و غیره بطور گسترده استفاده میشود افراد مرتبط با پژوهشهاي پروتئومیکس معمولاً در یک یا چند بخش از این قسمتها فعالیت میکنند .
جداسازي پروتئینها
تمامی تکنولوژیهاي پروتئومیکس به توانایی ما در خالص سازي و تفکیک اجزاء یک مخلوط پروتئینی وابسته است .
شناسایی پروتئینها
معمولاً توالی یک پروتئین بهترین شناسۀ آن است. روشهایی مانند روش توالی یابی ادمن به طور سنتی براي این منظور استفاده می شده اند، اما این روشها در کارهاي پروتئومیکس نمیتوانند کاربرد گسترده اي داشته باشند چرا که سرعت بسیار پایینی دارند درحال حاضر روشهاي طیف سنجی جرمی براي این منظور استفاده میشوند . داده اي که از این روشها بدست می آید معمولاً یکسري وزن مولکولی قطعات پپتیدي (اثر انگشت جرمی پپتید) و یا در دستگاه هاي پیشرفته تر چند توالی کوچک از بخشهاي مختلف پروتئین است. بعداً این داده ها را میتوان با داده هاي موجود در بانکهاي اطلاعاتی توالی پروتئینها مقایسه کرد و پروتئین مورد مطالعه را شناسایی نمود. امروزه از تراشه هاي پروتئینی هم ممکن است استفاده شود و پروتئینها را برحسب ویژگیهاي اتصالی آنها (که میتواند منحصر به فرد باشد) شناسایی میکنند .
اندازهگیري میزان پروتئین
براي اندازه گیري پروتئین از رنگ آمیزي معمولی ژلها به همراه نرم افزارهاي آنالیز تصویر میتوان استفاده کرد. در رنگ آمیزي افتراقی، دو نمونه مختلف به وسیله دو رنگ فلورسانت متفاوت برچسب گذاري میشوند و به طور همزمان روي ژل از همدیگر تفکیک می گردند. از روي رنگی که هر لکه روي ژل دارد میتوان به میزان بیان پروتئین درهریک از نمونه ها پی برد. روشهاي مختلفی نیز براي آنالیزهاي غیروابسته به ژل طراحی شده اند که از میان آنها میتوان به برچسب گذاریهاي تمایلی اشاره نمود .
آنالیزهاي محاسباتی توالی پروتئینها
مهمترین هدف در این بخش شناسایی یک پروتئین مجهول از میان یک بانک اطلاعاتی بزرگ از پروتئینهاست ، اما شناسایی دومینها ، پیشبینی عملکرد پروتئینها و شناسایی روابط تکاملی پروتئینها هم در این بخش مد نظر است .
پروتئومیکس ساختاري
در این بخش تلاش میشود ساختار سه بعدي پروتئینهاي یک پروتئوم با سرعت قابل قبولی تعیین گردد. در حال حاضر از ابزارهایی نظیر کریستالوگرافی اشعه X و نیز NMR براي این منظور بهره برده میشود .
پروتئومیکس برهمکنشها یا اینتراکتومیکس
در این بخش برهمکنش پروتئینها مورد مطالعه قرار میگیرد. مهمترین ابزاري که براي این منظور استفاده گردیده تکنیک دوهیبریدي مخمر (Y2H) میباشد. از تراشه هاي پروتئین نیز براي شناسایی برهمکنشها استفاده میشود .
شناسایی تغییرات پروتئینها
تقریباً تمامی پروتئینها کم وبیش با آنچه که از ترجمه خالص رونوشت ژنی آنها پیش بینی میشود تفاوتهایی دارند که به خاطر تغییرات شیمیایی پس از ترجمه حاصل شده است. روشهاي خاصی براي مطالعه این تغییرات ابداع شده اند که از میان آنها میتوان به فسفوپروتئومیکس (مطالعه فسفریله شدن پروتئینها) و گلیکوپروتئومیکس (مطالعه گلیکوزیله شدن پروتئینها) اشاره نمود .
پروتئومیکس سلولی
هدف این بخش، که قدمت چندانی ندارد، شناسایی محل دقیق پروتئینها و نوع برهمکنشهاي پروتئینی در رخدادهاي مختلف سلولی است. از جمله ابزارهایی که دراین بخش مورد استفاده قرار می گیرند میتوان به توموگرافی اشعه X و میکروسکوپ فلورسانس اشاره نمود .
برای داشتن دیدی بهتر و جهت دانلود خلاصه این کتاب شامل بخشهای زیر:
1- مقدمه و مفاهیم اولیه پروتئومیکس
2- تاریخچه پروتئومیکس
3- کاربردهای پروتئومیکس
4- وضعیت پروتئومیکس در جهان
5- دورنمای پروتئومیکس
همچنین مقالات زیر که در مورد پروتومیکس می باشد را مطالعه فرمایید .
جدول خصوصیات و کاربرد ژلهای کروماتوگرافی در ژل فیلتراسیون
Sephacryl :
از پیوندهای عرضی بین آلیل دکستران و N,N’-methylenebisacrylamide تهیه می شوند .گرید HR دارای اندازه ذرات کوچکتری است . توزیع اپتیمم شده و جداسازی بهتر و جریان سریعترمی باشد .
توضیح بیشتر در مورد ژلهای Sephadex و Sepharose ، در ادامه مطلب
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
رنج جداسازی ژل فیلتراسیون کروماتوگرافی بر اساس جرم مولکولی پروتئین ها
ژل کروماتوگرافی , پروتئین ها , پپتیدها , و الیگونوکلئوتیدها را بر اساس اندازه جداسازی می نماید . مولکولها از میان بستری از خلل و فرج ذرات ژل حرکت و به اندازه های کوچکتر یا بزرگتر رتبه بندی می شوند . مولکولهای کوچکتر با هم در خلل و فرج ذرات ژل نفوذ کرده , از اینرو حرکت آنها کند تر است . در صورتیکه درشت مولکولها کمتر وارد آن شده سرعت آنها بیشتر است . هر دو عامل جرم مولکولی و شکل فضایی در مقدار نگهداری شرکت دارند . ژل فیلتراسیون در آنالیز اندازه مولکولی , جداسازی یک مخلوط نمونه و یا در نمک زدایی یا تعویض بافر در تهیه ماکرومولکولها , استفاده می شود .
محدوده جرم مولکولی برای ژلها :
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
اساس کروماتوگرافی بر اصول کلی پخش فاز بنیان نهاده شده است. به طور خلاصه، در این روش جریان یک فاز از داخل فاز ساکنی میگذرد و در این حال فاز ساکن اجزای آنرا به طور انتخابی خارج میکند. این خروج یک عمل تعادلی است و مولکولهای اجزاء دوباره داخل فاز متحرک میشوند. هنگامی که ثابت پخش دو یا چند جزء در این دو فاز با هم متفاوت باشند، اجزای موجود در فاز متحرک از هم تفکیک میشوند. به طور ساده میتوان گفت که هر چه فاز ساکن یک جزء را محکمتر نگه دارد، در صد مولکولهای جزئی که بی حرکت نگه داشته شده بیشتر میشود. جزء دیگری که با شدت کمتر نگه داشته میشود نسبت به جزء اول در فاز متحرک درصد مولکولی بیشتری خواهد داشت. بنابراین به طور متوسط مولکولهای جزئی که با شدت کمتر نگه داشته میشوند، نسبت به مولکولهای دیگر با سرعت بیشتری در حرکتند . در نتیجه جداسازی انجام می شود .
فاصله باندها به طور خطی به مسافتی که در ستون طی میشود بستگی دارد. به طور کلی هر چه مسافت طی شده بیشتر باشد، فاصله باندها زیادتر خواهد شد. یادآور میشود که اجزای مخلوط باید ضرایب پخش متفاوتی داشته باشند تا بتوان آنها را به کمک پخش فاز تفکیک کرد. در صورتی که این ضرایب به هم نزدیک باشند، اجزای مربوط فقط به طور جزئی به باندهای جداگانه تفکیک میشوند. البته میتوان طول مسیر را زیاد کرد و به اجزاء فرصت داد تا بیشتر از هم جدا شوند .
انواع آن :
کروماتوگرافی چهار نوع مهم دارد که بر اصول توصیف شده بالا متکی هستند . این انواع عبارتند از کروماتوگرافی گازی (کروماتوگرافی تفکیکی گاز مایع) ، کروماتوگرافی ستونی ، کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) و کروماتوگرافی کاغذی .
ما در اینجا 4 نوع مهم از کروماتوگرافی ستونی , که از آنها برای جداسازی پروتئینها نیز استفاده می شوند نام برده و توضیح می دهیم .
اين نوع کروماتوگرافي براي اولين بار در سال 1954 معرفي و در سال 1959 اصلاح شد . در اين روش , جداسازي‌هایي مبتني بر الک کردن مولکولي بر روي اجسام بي‌بار در جريان مهاجرت الکترو اسمزي از داخل ژلها انجام مي‌شود . بدين ترتيب که جداسازي بر مبناي اندازه‌هاي نسبي مولکول ها انجام شده و از اصطلاح صاف کردن به وسيله ژل استفاده مي‌شود . ژل استفاده شده در اين روش بايد بي اثر و پايدار باشد . فاز ساکن از يک قالب متخلخل تشکيل شده که منفذهاي آن به وسيله حلالي که فاز متحرک را تشکيل داده پر شده است . از آنجا که اساس جداسازي بر اين است که مولکول‌هاي بزرگ تر از حد وارد سوراخ‌ها نشده و به ترتيب جرم مولکولي از ستون خارج شوند و مولکول‌هاي کوچک تر بر حسب شدت نفوذشان سوراخ ها را پر کنند پس اندازه سوراخ بسيار مهم است . همچنين گرانروي نمونه نيز اهميت زيادي دارد و نبايد از دو برابر گرانروي شوينده بيشتر باشد . از ديگر عوامل مهم حجم نمونه است بدين ترتيب که هر چه حجم نمونه کمتر باشد ، غلظت هر جزء در محلول خارج شده نيز کمتر خواهد بود . همچنین باندها شارپ تر خواهند شد . مثالی از این ژلها مانند خانواده Sephadex , خانواده Sephacryl
ژل فیلتراسیون یک روش ساده و قابل اطمینان , جهت جدا سازی مولکولها بر اساس سایز آنها می باشد , که برای جداسازی و تخلیص انواع مواد بیولوژیکی که به سهولت با روشهای دیگر امکان پذیر نیست , کاربرد دارد . جدا سازی در ژل فیلتراسیون به دو صورت رخ می دهد . جداسازی (separation) و جزء به جزء (fractionation) شدن . در گروه separation مولکولها به وسیله اختلاف زیاد در مولکولار سایزشان جدا می شوند . یک ماتریکس طوری مولکولها را انتخاب می کند که , مولکولهای درشت تر از میان حجم تهی ستون به اسانی و بدون درگیری شسته شود . در حقیقت مولکولهای کوچک تر در حجم کلی ستون نگه داشته می شوند . در گروه fractionation ماکرو مولکولها بر اساس اختلاف اندازه جدا می شوند . در این کارکرد , تمام اجزاء با اندازه های مولکولی متفاوت مطابق با دامنه جداسازی ژل , درگیر خواهند شد . کاربرد fractionation در ژل فیلتراسیون , تخلیص و تعیین جرم مولکولی پروتئین ها و پپتیدها و اسیدهای نوکلوئیک می باشد .
در حال حاضر ژل هایی مطرح شده اند که resolution بی مانند , در سرعت های بالا و مقاومتی بالا در مقابل فشار و PH دارند .
در زیر جداسازی یک نمونه محتوی پروتئین A با جرم مولکولی 290,000 , پروتئین B با جرم مولکولی 140,000 , serum albumin با جرم مولکولی 67,000 , ovalbumin با جرم مولکولی 43,000 , cytochrome c با جرم مولکولی 12,400 در یک ستون کروماتوگرافی که با fractionation range 15,000 - 150,000 Bio-Gel P-150 . پر شده است , ملاحظه می شود . وقتی که مخلوط پروتئین بر روی ستون گذاشته می شود . پروتئین A اول از همه شسته خواهد شد , زیرا جرم مولکولی آن از محدوده بالایی جداسازی ژل بیشتر است . بنابراین کلا درون خلل و فرج فاز ساکن نمی شود و در فضای خالی بین ذرات ژل (حجم تهی)(V0) ادامه مسیر می دهد . جرم مولکولی cytochrome c از محدوده پایینی جداسازی ژل کمتر است و به طور کامل با ژل درگیر می شود و آخر از همه شسته می شود . پروتئین های دیگر که اندکی درگیر می شوند , به ترتیب نزولی جرم مولکولی شسته خواهند شد .
Vr=V0+KVi
Vr حجم نگهداری پروتئین می باشد . V0 حجمی از فاز متحرک است که بین ذرات فاز ساکن اشغال کرده است (حجم تهی). Vi حجمی از فاز متحرک که درون خلل و فرج ذرات ژل اشغال کرده است (حجم درگیری). K ضریب تفکیک پروتئین است . (مقداری که هر پروتئین می تواند در خلل و فرج فاز ساکن نفوذ کند , که مقدار آن بین 1 و 0 است) . K در مخلوط پروتئینی بالا , برای پروتئین A برابر 0 می باشد .K=1 برای cytochrome c و برای سایر پروتئینهایی که در محدوده جداسازی این ژل است , K بین 0 و 1 می باشد .
ژل فیلتراسیون در جداسازی پروتئین ها بر اساس جرم مولکولی و همچنین برای تعویض بافر استفاده می شود . یک پروتئین حل شده در بافر سدیم استات دارای PH=4 می تواند در یک ستون ژل فیلتراسیون به تعادل رسیده با بافر Tris و PH=8 به کار برده شود . بافر Tris با PH=8 فاز متحرک است . پروتئین در داخل فاز متحرک , در جریان است و مولکولهای بسیار کوچکتر سدیم استات , کاملا درگیر با خلل و فرج ذرات ژل می باشند و نسبت به پروتئین با سرعت کمتری حرکت می کنند .
کروماتوگرافي تبادل يوني :
در اين روش بين فاز متحرک (محلول) و فاز ساکن (جامد) به صورت برگشت پذير يون مبادله مي‌شود . جامد تشکيل‌دهنده فاز ساکن رزين ناميده مي‌شود و پايداري مکانيکي و شيميايي و يکنواختي اندازه ذرات از خصوصيات آنها است. قالب اين رزين‌ها بر پايه يک بسپار بزرگ (معمولا پلي استيرن) استوار است اما برخي از آن ها متکي بر اسيد متا اکريليک هستند ، رزين‌ها به دو نوع تعويض کننده آنيوني و کاتيوني تقسيم مي شوند . هر کدام از اين تعويض کننده‌ها به نوع بازي ضعيف و قوي و اسيدي ضعيف و قوي تقسيم مي‌شوند . مي‌توان اين روش را مانند کروماتوگرافي جذبي در نظر گرفت به گونه اي که رزين‌ها جايگزين جاذب شده باشند. رزين‌ها بايد داراي گروه‌هاي مبادله کننده تک عاملي باشند و درجه اتصالات عرضي کنترل شده داشته باشند . گستره اندازه ذرات نيز بايد تا آنجا که ممکن است کوچک باشد . با اين روش کروماتوگرافي مي‌توان محلول‌هاي رقيق را به خوبي جداسازي کرد .
کروماتوگرافی تعویض یونی بر پایه برهمکنش متقابل بار- بار بین پروتئینهای نمونه و مجموع بار رزینی که انتخاب شده , می باشد . کروماتوگرافی تعویض یونی به کاتیون اکس چنج کروماتوگرافی که بار مثبت یونها در آن با بار منفی رزین باند می شود وآنیون اکس چنج کروماتوگرافی که بار منفی یونها با جمع بارهای مثبت گروه وابسته به رزین باند می شود . یک مرتبه توسط محلول معین , ستون شسته می شود تا به تعادل برسد . این محلول , بافر آغازین نامیده می شود که باید قدرت یونی کمی داشته باشد . سپس با استفاده از بافر دومی که دارای شیب غلظتی است و به طور پیوسطه قدرت یونی آن بالا می رود , مولکولهای معین شسته می شوند . پیوسطه PH بافر شوینده اصلاح می شود و پروتئینی که بار آن با ماتریکس اثر متقابل ندارد , شسته می شود . اگر PH مورد نیاز برای run کردن نمونه را بدانید , می توانید نوع کروماتوگرافی تعویض یونی لازم برای منحنی توالی پروتئین را تعیین کنید . اگر در PH مورد نظر , بار پروتئین منفی است , از تعویض کننده بار منفی ( آنیون اکس چنج ) و اگر مثبت است , از تعویض کننده مثبت ( کاتیون اکس چنج ) استفاده کنید . در اکثر حالتها , ممکن است بهتر باشد که شرایطی را انتخاب کنیم که در آن شرایط پروتئین مورد نظر ما از میان ستون جریان یابد و سایر پروتئین های اضافه با ستون باند شوند . این سبک از باند شدن را جریان سراسری می نامند . این سبک برای آنیون اکس چنج بسیار خوب است . از این سبک می توان برای باند شدن اندوتوکسین و یا موادی که بار بسیار بالایی دارند و همزمان جریان پروتئین شما از میان ماتریکس مورد نظر , استفاده کرد .
آنیون اکس چنج کروماتوگرافی :
بار خالص سطحی محلول ( پروتئین ها , اسیدهای نوکلوئیک , اندوتوکسین ) وقتی که باند می شوند ؛ منفی است . بنابراین برای باند شدن پروتئین ویژه ای باید , بالای نقطه ایزو الکتریک پوینت ( PI ) آن پروتئین باشیم . رزین های معمول برای آنیون اکس چنج کروماتوگرافی عبارتند از Q-resin و DEAE resin .
آنیون اکس چنج کروماتوگرافی عمدتا اولین کروماتوگرافی استفاده شده می باشد . به خاطر ظرفیت زیاد , ( این ماتریکس ها می توانند به 10 تا 100 mg پروتئین برای هر ml ژل باند شوند ) . و توانایی باند شدن و جداسازی اسید نوکلوئیک ها و لیپو پلی ساکاریدها از محلول اولیه . به طور نمونه AEC انجام شده در بافرهایی که PH آن بین 7 تا 10 است و جاری شدن یک گرادیانت از یک محلول که محتوی این بافر و محلول NaCl 1M است . نمک در محلول برای باند شدن با سطح ماتریکس در رقابت است و باعث رها شدن پروتئین هایی که باند شده اند می شود . از AEC در موارد زیر استفاده می شود : شستشوی اولیه نمونه آبکی , جدا کردن پروتئین از دیگر پروتئین ها , تغلیظ پروتئین و جدا کردن اندوتوکسینی که دارای بار منفی است از نمونه .
کاتیون اکس چنج کروماتوگرافی :
بار خالص سطحی محلول ( پروتئین ها , اسیدهای نوکلوئیک , اندوتوکسین ) وقتی که باند می شوند ؛ مثبت است . بنابراین برای باند شدن پروتئین ویژه ای باید , زیر نقطه ایزو الکتریک پوینت ( PI ) آن پروتئین باشیم . رزین های معمول برای کاتیون اکس چنج کروماتوگرافی عبارتند از S-resin و CM resin .
CEC در مقایسه با AEC کمتر معمول است . این به خاطر این است که اغلب پروتئین ها در PH های زیادی به این رزین نمی چسبند و میلی به تیتر شدن ندارند . با این وجود برای جداسازی اولیه , از نظر ظرفیت بالای آن , با AEC برابری می کند . به طور نمونه CEC انجام شده در بافرهایی که PH آن بین 4 تا 7 است و جاری شدن یک گرادیانت از یک محلول که محتوی این بافر و محلول NaCl 1M است. از CEC در موارد زیر استفاده می شود : شستشوی اولیه نمونه آبکی , جدا کردن پروتئین از دیگر پروتئین ها , تغلیظ پروتئین و گامی اولیه در تخلیص پروتئین های ویژه ای که تحت شرایط اسیدی هستند .
بافرهایی که در کروماتوگرافی آنیون اکس چنج مورد استفاده قرار می گیرد :
بافرهایی که در کروماتوگرافی کاتیون اکس چنج مورد استفاده قرار می گیرند :
سیستم AEC
Tris 20 mM ,PH=8.0 :بافر A
Tris 20 mM ,NaCl 1 M ,PH=8.0 :بافر B
1- ستون با بافر A به تعادل می رسد .
2- پروتئین(نمونه) دیالیز شده در بافر A به ستون می چسبد .
3- ستون توسط یک گرادیانت خطی که از 100% A تا 100% B تغییر می کند , شسته می شود .
سیستم CEC
sodium acetate 30 mM ,PH=4.5 :بافر A
sodium acetate 30 mM ,NaCl 1 M ,PH=4.5 :بافر B
1- ستون با بافر A به تعادل می رسد .
2- پروتئین(نمونه) دیالیز شده در بافر A به ستون می چسبد .
3- ستون توسط یک گرادیانت خطی که از 100% A تا 100% B تغییر می کند , شسته می شود .
سیستم AEC برای پروتئین هایی که انحلال پذیری کمی دارند یا PI خیلی بالایی دارند :
Ethanolamine 30 mM ,urea 8 M ,PH=10.0 :بافر A
Ethanolamine 30 mM ,urea 8 M ,NaCl 1 M ,PH=10.0 :بافر B
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
پذیرش مقالات ,آموزش , مشاوره و شرکت در طرحهای تحقیقاتی و تولیدی و پایان نامه های دانشجویی در رابطه با تخلیص پروتئین ها با روشهایی مثل الکتروفورز کروماتوگرافی و غیره (وابسته به مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی ، کرج)
روز بخير كاربر مهمان! 
